Proton translocation mechanism and energetics of a light-driven pump, Gloeobacter rhodopsin
- 발행기관 서강대학교 대학원
- 지도교수 정광환
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 200702
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 생명과학
- 식별자(기타) 000000103839
- 본문언어 영어
초록/요약
Genome sequencing of microorganisms starts to show the presence of archaeal type (Type I) rhodopsin homologues in many bacterial genome. Microbial rhodopsins are retinal-binding, seven transmembrane helix proteins which function as ion pumps and sensory receptors. A gene encoding a homologue of type I microbial rhodopsin was found in the genome of a unicellular cyanobacterium, Gloeobacter violaceus PCC7421 (www.kazusa.or.jp), which is believed to be a primitive cyanobacterium because of lack of thylakoid and morphology of phycobilisome. The Gloeobacter rhodopsin (GR) gene encoded a polypeptide of 298 amino acids, with a molecular weight of 33 kDa. This gene is localized alone in the genome unlike Anabaena opsin which is together with 14 kDa transducer gene. It has seven transmembrane helices that form a pocket in which all-trans retinal is covalently linked to the lysine as a Schiff base in helix G. Based on amino acid sequence comparison of GR with other type I rhodopsins it was found that several conserved residues important for retinal binding and H+ pumping among the pumping opsin families. The gene was functionally expressed in Escherichia coli and bound all-trans retinal to form a pigment and show a light-driven pumping activity like proteorhodopsins. The pigment did not exhibit proton transport activity when Asp121(Asp85 in BR) was replaced with Asn and Glu132 (Asp96 in BR) to Gln in GR. These mutant proteins shifted the absorption maximum from 542 nm (WT GR) to 564 and 554 nm (D121N and E132Q). The pKa of Asp121, proton acceptor which receives H+ released from Schiff base, is approximately 6.0, and Gloeorhodopsin can translocate H+ in physiological (pH 7.4) condition using different wavelength of light to chlorophyll. In order to prove the functional activity in the cell, pumping activity was measured in the sphaeroplast membrane and whole cells of E. coli and Gloeobacter. As a result, it was assumed that GR pumps the proton outside of the cell together with chlorophyll based machinery. The efficient proton pumping and rapid photocycle of this GR pigment strongly suggests that Gloeobacter rhodopsin functions as a proton pump in its natural environment, probably compensating the shortage of energy generation only by chlorophyll-based photosynthesis without thylakoid. Gloeobacter violaceus is a key organism for understanding the evolution of membrane-based energy generating system.
more초록/요약
미생물의 genome sequencing은 많은 박테리아의 genome에서 archaeal type (type I) rhodopsin들 간에 상동성이 있다는 것을 알려 준다. 미생물 rhodopsin은 크게 이온 펌프와 감각 기관을 하는 두 부류로 나뉘어 진다. Gloeobacter violaceus PCC7421에서 type I인 미생물 rhodopsin의 유전자와 상동성이 높은 유전자가 발견되었다 (www. kazusa.or.jp). Thylakoid가 없고, phycobilisome 형태인 G. violaceus PCC7421은 원시적인 형태의 cyanobacterium이라고 믿어 진다. Gloeobacter rhodopsin (GR) 유전자는 분자량이 33 kDa인 298 아미노산 폴리 펩티드로 이루어져 있다. Opsin 유전자와 14 kDa transducer 유전자가 함께 있는 Anabaena 와는 다르게, 이 유전자는 genome에서 혼자 위치한다. GR은 helix G의 Lysine기가 Schiff base로써 all-trans retinal과 공유 결합을 하고 있는 pocket 형태로 seven transmembrane을 가진다. GR과 type I의 rhodopsin들 간의 아미노산 서열을 비교해 보면, retinal binding하는 residue와 특히 proton pumping rhodopsin family에서 proton pumping에 중요한 residue가 서로 보존되어 있는 것을 확인할 수 있다. E. coli에서 발현된 Gloeobacter opsin은 chromophore인 all-trans retinal과 결합해서 proteorhodopsin과 같이 light-driven pumping activity를 보였다. GR에서 Asp121 (Asp85 in BR)이 Asn으로, Glu132 (Asp96 in BR)이 Gln으로 바뀌면, 이 chromophore에는 proton transport activity가 없어진다. 이런 돌연변이를 통해, 최대 흡수 파장이 542 nm (WT GR)에서 564 nm, 554 nm (D121N, E132Q)로 이동하는 것을 발견했다. Schiff base가 방출하는 proton을 받는 역할을 하는 proton acceptor인 Asp121의 pKa는 대략 6.0 이다. GR은 chlorophyll이 사용하는 빛이 아닌 다른 파장을 이용해서 생리적인 (pH 7.4) 조건에서 수소 이온을 이동시킬 수 있다. Gloeobacter cell에서 기능적인 역할을 증명하기 위해서, E. coli와 Gloeobacter의 전체 cell과 sphaeroplast membrane을 이용해서 proton pumping activity를 측정했다. 그 결과 chlorophyll을 기초로 하는 Gloeobacter에서 GR 역시 cell의 바깥으로 수소를 이동할 것이라고 추측된다. GR pigment의 효율적인 proton pumping과 빠른 광순환은 GR이 자연 환경에서 proton pumping으로서의 역할을 한다는 것을 뒷받침한다. Thylakoid가 없는 Gloeobacter에서 chlorophyll-based 광합성으로부터 생성되는 에너지의 부족함을 GR이 메꾸어 줄 것이다. Gloeobacter violaceus는 에너지 생산 system을 기초로 하는 membrane의 진화를 이해하는 데 있어 중요한 생명체이다.
more