Identification of Novel Phospholipids and Glycolipids Species in Lipid Extracts using Accurate Mass Measurements by Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry
- 발행기관 서강대학교 대학원
- 지도교수 오한빈
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 200702
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 바이오융합기술 협동과정
- 식별자(기타) 000000103677
- 본문언어 영어
초록/요약
Lipids are essential not only as energy storages or structural components of cellular membranes but also as a vital role player in a variety of biological processes such as signal transduction, morphogenesis, prevention of water loss through the skin, and collapse of lung alveolae. Analysis of a variety of lipid species through mass spectrometric methods has been utilized for many years, which includes electron ionization (EI), field desorption, chemical ionization (CI), plasma desorption, thermospray/EI, laser desorption, and fast atom bombardment (FAB). In particular, FAB-MS has been widely used in the lipid analysis as this method imparts many advantages that allow one even to reveal information of residue chains of the lipid species. FAB-MS can also reveal the information of not only residue chains linked at sn-1 and sn-2, but also the position of the double bond for each chain. However, FAB-MS analysis is a time-consuming method. In contrast to this limitation, Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (FTICR-MS) has found an increasing use with many unique advantages such as high resolution and accuracy that other mass spectrometry methods cannot provide. According to the analysis of Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) with matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-FTMS by Wilkins and coworkers, 18.62% of the whole compound compositions have another lipid species within the mass difference between 0.01 and 0.001 Da. In addition, given that the cation species attached to the compound of interest is known, it was found that 21.38 ppm is the minimum mass accuracy needed for lipid identification. This accuracy can be easily obtainable in routine analysis by FTICR-MS that often exhibits the resolving power of 90,000 and higher below m/z 1000. Based upon this theoretical consideration, in the present study we have tried to verify the validity of the direct-infusion ESI-MS method for the lipid analysis. The lipid candidates were chosen by comparing the measured m/z values with the ones in the web-based lipid database and then were further confirmed by MS/MS approach utilizing the linear ion-trap mass spectrometry. As specific examples, the extracts form porcine brain, bovine liver, and soybean were analyzed both in positive and negative ion modes. With the mass tolerance of 30 ppm, 80 and 39 lipid species were identified for porcine brain, respectively; 76 and 35, in bovine liver; 42 and 29, in soybean. In the case of Halobacterium salinarum (H. Salinarum) which were cultured in dark environment, 10 novel lipid species containing phosphatidylglycerol sulfate were confirmed in negative ion mode, which is consistent with the previous literature. This clearly shows a promising application to the real biological application for the analysis of lipids extracts. In the near future, lipid extracts of H. Salinarum which will be cultured in strong light environment will also be studies using the direct-infusion ESI-MS method. It is expected that comparison with cultured in both environments can give us the difference between the lipid extracts cultured in the two different environment, in the both quantitative and qualitative manner.
more초록/요약
지질류는 세포막을 이루는 구조적 성분뿐만 아니라 에너지 저장과 신호전달, 세포막 형태 형성, 피부를 통한 수분 유출 방지, 폐포의 붕괴 방지 등 생물학적, 대사적 과정에서 매우 중요한 역할을 한다. 이렇게 중요한 생물학적 역할을 지닌 지질류의 질량분석기를 이용한 분석 방법은 다양하게 발전되어왔다. 다양한 방법 중 이온화 방법에 따른 분류로 나누자면 가장 대표적인 예로써는 electron impact (EI), field desorption, chemical ionization (CI), plasma desroption, thermospary/EI, laser desorption, fast atom bombardment (FAB) 등을 들 수 있다. 이들 중 FAB-MS는 강한 보편적으로 이용되는 이온화 방법으로써, 지질류의 가지 사슬에 대한 모든 정보를 손 쉽게 알아 낼 수 있다는 장점으로 인해 널리 사용되어 왔다. sn-1, sn-2 위치에 붙어있는 사슬에 대한 정보뿐 만 아니라 각 사슬에 포함된 이중결합의 위치까지 분석할 수 있다. 하지만 시간이 걸리는 분석 방법이라는 한계점을 가지고 있다. 이러한 한계점을 극복하기 위해 우수한 고정확도, 고분해능 등의 장점을 지닌 극초분해능 질량분석기(Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance mass spectrometry, FTICR-MS)의 활용도가 최근에 들어 증가하고 있다. 최근에 Wilkins의 Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-FTMS를 이용한 Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) 연구에서 밝혀졌듯이, 보통의 지질류가 가지는 질량범위 내에서 (500-1200 m/z) 0.01 Da 과 0.001 Da 실험 측정치 사이에 다른 지질류가 존재하는 확률이 전체지질류의 18.62 %를 차지한다고 한다. 또 다른 의미로는 양이온을 이루는 화학종, 즉, H+, Li+, Na+, K+ 등을 알고 있다는 가정하에 분자 종을 확인하기 위한 최소 질량 정확도는 21.38 ppm으로 알려져 있다. 이 값은 FTMS 극초분해능 질량분석기에서 어렵지 않게 구현할 수 있는 약 90,000 의 분해능으로 m/z 1000 이하에서 정확한 질량 값만으로도 화학 종을 확인할 수 있음을 의미한다. 본 연구에서는 이러한 기존의 이론적 결과에 착안해, 실제로 직접-주입 전기분무이온화 (Direct-infusion ESI-MS) 방법을 도입해 지질 추출물에 대한 지질류 확인을 시도할 때, 정확한 지질류의 확인이 가능한지에 대한 실험을 시도하였다. 고 질량 정확도를 가진 질량분석기를 이용하여 얻은 질량값을 이용하여 웹-데이터베이스상의 지질 후보군을 찾아내고, 이들이 실제로 정확히 확인되었는가를 검증하기 위하여 선형이온트랩 질량분석기 (Linear ion trap mass spectrometer, LIT-MS)를 이용하여 직접-주입 전기분무이온화 질량분석법으로 확인한 지질에 대해서 MS/MS를 통하여 구조적인 검증을 행하였다. 돼지의 뇌, 소의 간, 콩에서 추출한 지질 추출물로 양이온 모드와 음이온 모드에서 30 ppm 의 mass tolerance를 가지고 분석한 결과, 돼지의 뇌에서는 각각 80개 및 39개의 지질류가 확인되었으며, 소의 간에서는 각각 76개 및 35개의 지질류가 확인되었다. 콩에서는 42, 29 개의 지질 종이 발견되었다. 어두운 환경에서 키운 H. Salinarum 의 지질 추출물의 경우, 이미 문헌들에 알려진 PGS를 포함한 총 10개의 지질 종들을 모두 확인했다. 이는 실제 생물학적 시료에 대한 직접-주입 전기분무이온화 질량분석법의 응용 가능성을 확인한 결과로, 본 연구 방법이 타당한 실험방법임을 보여준다. 향후 빛이 허용된 환경에서 자란 H. Salinarum 에 대한 지질 추출물에 대한 분석결과를 바탕으로 특정 지질 종에 대한 정량적, 정성적인 분석까지 가능할 것으로 예상한다.
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