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로타바이러스의 VP7과 VP4에 대한 cDNA 클로닝과 재조합 단백 생산

김경준 (Kim, Kyoung Jun)

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  • 발행기관 서강대학교 대학원
  • 지도교수 양재명
  • 발행년도 2007
  • 학위수여년월 200702
  • 학위명 석사
  • 학과 및 전공 생명과학
  • 식별자(기타) 000000103452
  • 본문언어 한국어
초록/요약moremore
로타바이러스는 고열, 구토 및 심한 탈수증을 유발하는 영.유아 장염의 가장 중요한 요인이다. 이러한 로타바이러스에 의한 급성 장염을 예방하기 위해서는 로타바이러스에 의한 감염을 막는 것이 중요하다. 본 연구에서는 로타바이러스에 대한 중화 항체의 생산을 유도하는 항원으로 알려져 있는 G유전자형의 VP7과 P 유전자형의VP4를 코딩하는 cDNA를 합성하고 이를 이용하여 중화항체 생산을 유도할 수 있는 항원을 대량 생산하였다. 로타바이러스 양성인 급성 장염 환자의 가검물로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR 방법으로 G, P 혈청형 (유전...
로타바이러스는 고열, 구토 및 심한 탈수증을 유발하는 영.유아 장염의 가장 중요한 요인이다. 이러한 로타바이러스에 의한 급성 장염을 예방하기 위해서는 로타바이러스에 의한 감염을 막는 것이 중요하다. 본 연구에서는 로타바이러스에 대한 중화 항체의 생산을 유도하는 항원으로 알려져 있는 G유전자형의 VP7과 P 유전자형의VP4를 코딩하는 cDNA를 합성하고 이를 이용하여 중화항체 생산을 유도할 수 있는 항원을 대량 생산하였다. 로타바이러스 양성인 급성 장염 환자의 가검물로부터 RNA를 추출하여 RT-PCR 방법으로 G, P 혈청형 (유전자형)을 조사하였다. 국내에서 가장 많이 유행하는 G타입 (G1, G2, G4, G9)과 P타입 (P[4], P[6])을 보인 가검물의 RNA로부터 VP7과 VP4를 코딩하는 전체 길이의 cDNA를 합성한 뒤 염기서열을 결정하였다. 염기서열로부터 유추한 아미노산 서열을 기존에 보고된 각 로타바이러스의 타입과 비교하였더니 모두 90% 이상의 상동성을 보였다. VP7과 VP4를 대량 발현하기 위하여 각 타입의 cDNA를 대장균 발현 벡터인 pET-23(+) vector에 삽입한 뒤 발현 균주인 pLysS에 형질전환 하였다. 로타바이러스 VP7과 VP4의 발현을 SDS-PAGE, immuno blot 분석으로 확인하였으며 발현을 극대화 시키는 조건하에서 대량 발현한 뒤 친화 크로마토그래피 방법을 사용하여 재조합 VP7과 VP4 단백질을 분리, 정제하였다. 정제한 재조합 VP7과 VP4 단백질을 생쥐에 주입하여 항체를 생산한 뒤 각각의 타입에 대한 교차도 (cross reactivity)를 관찰하였다. 그 결과 P[4] 타입 항체는 P[4], P[6] 타입의 항원에 비슷한 반응성을 보였으며 P[6] 타입 항체는 P[6] 타입 항원에 특이적인 반응성을 보였다. 그리고 G1 타입 항체는 G1 타입 항원에 특이적인 반응성을 나타냈다.
초록/요약moremore
Rotaviruses are the most common cause of nonbacterial diarrhea in infants and children worldwide. One of the ways to prevent acute gastroenteritis in childhood is to vaccinate against rotavirus infection. In this study, cDNAs coding for VP7 and VP4 of the most prevalent rotavirus G and P genotypes w...
Rotaviruses are the most common cause of nonbacterial diarrhea in infants and children worldwide. One of the ways to prevent acute gastroenteritis in childhood is to vaccinate against rotavirus infection. In this study, cDNAs coding for VP7 and VP4 of the most prevalent rotavirus G and P genotypes were synthesized. Using these cDNAs, recombinant VP7 and VP4 was expressed in E. coli and used for the production of antisera against rotavirus VP7 and VP4. Human rotavirus RNA was extracted from the rotavirus positive stools collected from the patients with acute gastroenteritis. G and P serotypes (genotypes) of the extracted RNA were determined by RT-PCR using genotype specific primer sets. It was found that G1, G2, G4, G9 types of VP7 and P[4], P[6] types of VP4 were the most prevalent rotaviruse genotypes. Subsequently full length cDNAs of these types were synthesized and nucleotide sequences were determined. Comparative analysis of amino acid sequences with the previously reported rotavirus genotypes indicated that the same genotype strains showed homology higher than 90%. To express a large quantity of VP7 and VP4 proteins, each type of cDNA was inserted into pET-23 (+) vector and recombinant pET-vector was transformed into pLysS E. coli cells. Expressed recombinant VP7 and VP4 proteins were confirmed by SDS-PAGE and immunoblot and then purified by affinity chromatography. Purified recombinant VP7 and VP4 proteins were injected into mice for producing antibodies. These antisera were investigated for the cross reactivity to VP7 or VP4 proteins. As a result, P[4] type antisera showed cross reactivity or ‘co-recognition’ with P[4] and P[6] type antigens. P[6] type antisera showed specific reaction with P[6] type antigen. G1 type antisera showed specific reaction with G1 type antigen.