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Characterization of new type anion pumping rhodopsins

김세환 (서강대학교 일반대학원)

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NTQ motif 와 TSD motif 를 형성하는 새로운 타입의 음이온 펌핑 로돕신을 광물리학적, 광화학적 그리고 광생물학적 실험 방법을 이용하여 동정하였다. 그렇게 동정된 로돕신들은 염소이온을 수송시키는 공통적인 성질로 인해 halorhodopsin으로 분류가 되었는데 그 안에서 각각 고유의 계통 분기를 형성하게 된다. Sargasoo 바다의 서쪽지역에서 분리한 α-proteobacterium Fulvimarina pelagi HTCC2506 에서 opsin 유전자를 찾아내었다. 그것은 NTQ motif 를 가지는 로돕신으로...
NTQ motif 와 TSD motif 를 형성하는 새로운 타입의 음이온 펌핑 로돕신을 광물리학적, 광화학적 그리고 광생물학적 실험 방법을 이용하여 동정하였다. 그렇게 동정된 로돕신들은 염소이온을 수송시키는 공통적인 성질로 인해 halorhodopsin으로 분류가 되었는데 그 안에서 각각 고유의 계통 분기를 형성하게 된다. Sargasoo 바다의 서쪽지역에서 분리한 α-proteobacterium Fulvimarina pelagi HTCC2506 에서 opsin 유전자를 찾아내었다. 그것은 NTQ motif 를 가지는 로돕신으로 아미노산 서열 비교를 해보면 기존의 이온 펌핑 로돕신과는 다른 새로운 타입의 로돕신이었다. 이번 연구에서는 흡수분광법, 이온펌핑활성 측정등을 통해 이 로돕신의 기본적인 성질 분석을 하였다. 이 로돕신은 pH7 에서 522nm 파장의 빛에 대해 최대 흡광도를 보였다. 그런데, pH 에 따른 흡광도 측정 시 최대 흡광 파장의 변화가 관찰되지 않았다. 한편, 광주기를 측정하였을 때 광주기가 빠르게 나타나는 전형적인 이온 펌핑 로돕신의 특성을 보여주었다. 이 로돕신은 막을 기준으로 하였을 때 수소 이온을 막 안쪽으로 이동시키는 기능적 특성을 보여주었다. 수소 이온이 막 안쪽으로 이동되는 현상은 Cl-, Br-, SO42- 와 같은 음이온들의 수송이 일어나기 때문에 나타나는 현상으로 간주된다. 즉 이것은 halorhodopsin 특이적으로 나타나는 특성이라고 할 수 있다. 추가적으로, 이 로돕신은 Cl 이온의 결여 시에 최대 흡광 파장이 pH7 에서 543nm 가 되며 거의 20nm정도의 굉장히 큰 적색편이 가 관찰되었다. 이 로돕신은 Cl- 외에 Br-, SO42- 도 수송을 하나, 기본적으로 Cl- 에 대한 이온친밀도가 높게 관찰이 된다. 위의 기본형 로돕신에 대한 기본적인 특성 측정에 더해서 여러가지의 돌연변이를 제작하였고, 기본형과 마찬가지로 특성 측정을 하여서 이온 수송의 경로를 규명하기 위한 연구를 진행 하였다. Scytonema cyanobacteria PCC10023 으로부터 opsin 유전자를 찾아 내었는데, 이 opsin 에는 이온수송의 기능을 하는 HR과 BR의 중요한 아미노산 잔기들(TSD motif)이 포함되어있음을 확인하였다. PCC10023 으로부터 분리한 로돕신은 pH7 에서 536nm 빛에 대해 최대 흡광도를 보였다. 이것은 BR 과 HR 의 최대 흡광 파장 비교를 해보았을 때 매우 큰 청색 편이를 일으킨 것이다. 이 로돕신은 HR 과 유사하게 염소 이온을 막을 경계로 이동시킬 수 있었다. 이 로돕신은 NTQ motif 를 가지는 halorhodopsin 과 유사하게 다른 음이온에 대해서도 이온 수송 능력을 가지는 것이 관찰되었다. PCC10023 에서 얻어낸 이 로돕신은 기존의 HR 과 유사하게 K, L, N, O 광중간산물을 가지는 광주기를 보이는 것으로 관찰되었다. 이전에 BR 에 한 개의 아미노산 돌연변이를 통하여 그 기능을 HR 의 것으로 바꾸는 연구가 보고된 바 있다. 그런데, 한대로 HR 을 BR 의 기능을 가지게 하는 돌연변이에 대한 연구는 보고된 바가 없다. 흥미롭게도 TSD motif 를 가지는 로돕신의 T74 아미노산의 돌연변이를 통해 이온 수송의 특성이 변하는 TSD motif 로돕신만의 특이적인 성질이 관찰이 되었다.
초록/요약moremore
New types (NTQ motif and TSD motif) of anion pumping rhodopsins are characterized by photo-physical, photo-chemical and photo-biological method. Those are grouped to halorhodopsin according to their chloride ion transportation property. At the same time, each type of halorhodopsins makes own clades ...
New types (NTQ motif and TSD motif) of anion pumping rhodopsins are characterized by photo-physical, photo-chemical and photo-biological method. Those are grouped to halorhodopsin according to their chloride ion transportation property. At the same time, each type of halorhodopsins makes own clades by their unique features. One opsin gene was identified in α-proteobacterium Fulvimarina pelagi HTCC2506 which is isolated from the wastern Sargasso Sea. It is NTQ type rhodopsin, new type microbial rhodopsin group, based on the comparison of primary sequences among other ion pumping rhodopsins. In this study, the basic characterization of this rhodopsin was performed by using absorption spectroscopy, measurements of ion pumping activity, etc. This rhodopsin has 522 nm λmax at pH 7. By the way, λmax of this protein is not changed by the pH condition. It showed fast photocycling rate of photo-intermediates and it is similar property like a typical ion pumping rhodopsin. Functionally, this rhodopsin showed inward proton movement. It seemed some anions are related to this phenomenon like Cl-, Br-, and SO42-. It is unique property of this type halorhodopsin. Additionally, this rhodopsin showed large red-shift with an absence of Cl ion (543nm at pH7). Even though this rhodopsin can pump both Cl- and SO42- , the Cl- showed better affinity than SO42-. Besides above, some mutants were constructed and characterized to verify the pathway of ion transportation. One opsin gene that we found from Scytonema, cyanobacteria possesses critical residues of HR and BR (TSD motif) involved in ion transportation. PCC10023 rhodopsin has 536nm λmax at pH7. It is a substantially blue-shifted for that of BR and HR. PCC10023 has chloride ion pumping activity like HR. It also transfered other anion like NTQ motif rhodopsin. PCC10023 seemed that it exhibits similar photo-intermediates (K, L, N, and O intermediates) to HR along the react to light illumination. Previous studies showed that a key residue mutant of BR functions like an HR, but the corresponding reverse mutation in HR did not function as BR. Interestingly, there is a function–altering change by PCC10023 T75 mutant which is about changing the ion pumping pattern. This altering is unique property of this rhodopsin.