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Identification of genes in Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, the expressions of which are modulated by an exogenous synthetic autoinducer

황원

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Rhodobacter sphaeroides 2.4.1의 quorum-sensing을 위한 신호물질로 알려진 7,8-cis-N-(tetradecenoyl)homoserine lactone (RAI-I)에 의해 발현이 조절되는 유전자를 이 세균의 genome 상에서 탐색하였다. spheroides 2.4.1의 genomic DNA를 Sau3AI으로 부분 소화하여 3-5 kb 크기의 DNA 절편만을 확보하고, 이 절편들을 자살 벡터인 pBSG3의 BamHI에 클로닝하여 genomic library를 구축하였다. 사용된 자살 벡터 pBSG...
Rhodobacter sphaeroides 2.4.1의 quorum-sensing을 위한 신호물질로 알려진 7,8-cis-N-(tetradecenoyl)homoserine lactone (RAI-I)에 의해 발현이 조절되는 유전자를 이 세균의 genome 상에서 탐색하였다. spheroides 2.4.1의 genomic DNA를 Sau3AI으로 부분 소화하여 3-5 kb 크기의 DNA 절편만을 확보하고, 이 절편들을 자살 벡터인 pBSG3의 BamHI에 클로닝하여 genomic library를 구축하였다. 사용된 자살 벡터 pBSG3는 muticloning site의 하단부에 promoterless lacZ와 promoterless aph을 가지고 있어 삽입하는 DNA의 transcriptional fusion이 가능한 벡터이다. 이렇게 구축한 library를 S17-1으로 transformation 시킨 후, ampicillin에 저항성을 보이는 23,000개의 clones을 얻어 신호물질을 합성할 수 없는 균주인 AP3T에 conjugation하였다. pBSG3는 R. sphaeroides 에서 복제가 불가능하므로streptomycin/spectinimycin이 첨가된 배지에서 자란 exoconjugant들은 모두 이 plasmid가 genome상으로 single crossover에 의하여 삽입되어짐으로써 무작위로 lacZ-접합을 이루게 된다. 이 중 외부에서 신호물질을 첨가한 후 -galactosidase의 활성을 정량분석 함으로써, RAI-I에 의하여 발현 조절이 되는 R. sphaeroides 2.4.1 균주의 genome 상의 삽입체를 23가지 얻을 수 있었다. 이 클론들의 genomic DNA를 추출하여 PstI으로 자른 후, self-ligation하여 DH5?로 transformation하였다. Ampicillin에 저항성을 가진 clone을 골라 pBSG3의 pl-lacZ의 염기서열을 primer로 하여 각 clone들의 삽입 DNA 염기서열을 결정하였다. 이 염기서열을 기존에 알려진 염기서열과 비교한 결과 대부분의 삽입 DNA에 의해 유추되는 아미노산 서열로 기존의 database 상에 알려진 단백질 서열과 비교한 결과 대부분 아직 그 기능이 정확하게 알려지지 않은 것들 이었다. 그러므로 본 연구결과를 통하여, quorum-sensing에 의해 조절되고 기존에 알려지지 않은 새로운 기능의 유전자들을 선별한 것으로 추측된다. 이렇게 얻어진 clone들의 삽입 부분에 대한 분자 수준에서의 연구와 그 DNA가 코딩하고 있는 단백질 기능에 대한 연구, 그리고 생리적인 역할에 대한 연구가 계속해서 진행 중이다.
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Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 is a free-living, photoheterotrophic Gram-negative bacterium that possesses a cell density-dependent regulatory system, generally termed quorum-sensing (QS). The cerR-cerI gene pair, which is a member of the luxR-luxI family, has been identified in this bacterium. Howev...
Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 is a free-living, photoheterotrophic Gram-negative bacterium that possesses a cell density-dependent regulatory system, generally termed quorum-sensing (QS). The cerR-cerI gene pair, which is a member of the luxR-luxI family, has been identified in this bacterium. However, biological role of the QS system in this organism is unclear, and structural genes controlled by the QS system remain to be systematically elucidated. To identify the genes controlled by QS, we constructed a genomic library of the bacterium in pBSG3, a suicide vector containing promterless lacZ (pl-lacZ) and promoterless kanamycin-resistant gene (pl-km) as reporters. More than 20,000 library clones were constructed, each of which contains a 3-5 kb genomic DNA fragment, and these clones were introduced into R. sphaeroides strain AP3T that is a cerI-null mutant strain. About 20,000 exoconjugants were obtained which contain pBSG3-derived random reporter fusions in the genome generated by single crossover between DNA in pBSG3 derivatives and the identical region in the genome of AP3T. Each of fusions was tested for the inducibility of the expression of reporter genes upon the addition of exogenous synthetic acyl-HSL (RAI-I) molecules. In this screening, we obtained 23 independent clones. Among these clones, 21 clones showed >2-fold induction of -galactosidase activities, and two showed >2-fold reduction of the activities in response to synthetic RAI-I. Most of the isolated genes show homologies with the hypothetical protein in databases.