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Development of stable Cell lines expressing human interferon-β

이상민

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Interferons (IFNs)은 항바이러스, 항암, 면역조절 등 중요한 활성을 갖는 사이토카인의 하나로 Ⅰ형과 Ⅱ형으로 나누어진다. IFN-β는 Ⅰ형에 속하며 in vitro 실험결과 대부분의 인간 암세포의 증식을 방해하는 활성을 갖는다. 인간 폐세포로부터 RT-PCR을 통하여 인간의 IFN-β 유전자를 클로닝 한 뒤 동물세포에서 huIFN-β를 과발현 시키기 위해 발현백터 pSRa-IFNβ를 건설하였다. 전사와 번역 효율을 높이기 위해 인간 IFN-β 유전자를 alfalfa mosaic 바이러스로부터 추출한 AMV RNA4 리...
Interferons (IFNs)은 항바이러스, 항암, 면역조절 등 중요한 활성을 갖는 사이토카인의 하나로 Ⅰ형과 Ⅱ형으로 나누어진다. IFN-β는 Ⅰ형에 속하며 in vitro 실험결과 대부분의 인간 암세포의 증식을 방해하는 활성을 갖는다. 인간 폐세포로부터 RT-PCR을 통하여 인간의 IFN-β 유전자를 클로닝 한 뒤 동물세포에서 huIFN-β를 과발현 시키기 위해 발현백터 pSRa-IFNβ를 건설하였다. 전사와 번역 효율을 높이기 위해 인간 IFN-β 유전자를 alfalfa mosaic 바이러스로부터 추출한 AMV RNA4 리더 서열과 연관시킨 SRa 프로모터 뒤에 클론하였다. pSRa-IFNβ에는 DHFR 유전자가 포함되어 있어 세포 배양 배지에 MTX를 첨가하여 유전자증폭이 가능하게 하였다. pSRa-IFNβ를 COS-7와 CHO/dhfr- 세포에 형질 도입한 뒤 ELISA 방법을 이용하여 배양 배지 내 인간 IFN-β의 발현 수준을 조사하였다. 형질 도입 60시간 후 pSRa-IFNβ를 형질 도입한 COS-7 세포의 인간 IFNβ의 발현 수준은 형질 도입하지 않은 COS-7 세포에 비해 약 30배 높았다. 또한, 형질 도입 48시간 후 pSRa-IFNβ를 형질 도입한 CHO/dhfr- 세포의 인간 IFNβ의 발현 수준은 형질 도입하지 않은 CHO/dhfr- 세포에 비해 약 32배 높았다. 인간 IFN-β를 과발현 하는 stable cell line을 개발하기 위해 pSRa-IFNβ를 CHO/dhfr- 세포에 형질 도입한 뒤 zeocin을 함유하고 있는 배지에서 zeocin에 저항성을 갖는 세포주를 선별하였다. 선별된 CHO/dhfr- 세포의 인간 IFNβ의 발현 수준을 높이기 위해 MTX 농도를 점진적으로 증가시킨 배지에서 배양하였다. 선별된 세포의 배양 배지를 대상으로 immunoblot 분석 결과 zeocin과 MTX에 저항성을 띄는 CHO/dhfr- 세포에서 안정적으로 인간 IFN-β가 과발현 됨을 확인하였다.
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Interferons (IFNs), classified into type and type classes, are important cytokines characterized by antiviral, anticancer and immunomodulatory activities. IFN- , belongs to the type class, has potent antiproliferative activity against most human tumor cells in vitro. cDNA coding for human IFN-...
Interferons (IFNs), classified into type and type classes, are important cytokines characterized by antiviral, anticancer and immunomodulatory activities. IFN- , belongs to the type class, has potent antiproliferative activity against most human tumor cells in vitro. cDNA coding for human IFN- (huIFN- ) was cloned from human lung cells by RT-PCR. For high level expression of huIFN- in mammalian cells, a mammalian expression vector was constructed. cDNA coding for huIFN- was placed under the control of SR promoter which is linked to the untranslated leader sequences derived from alfalfa mosaic virus (AMV RNA4 leader) to improve translational efficiency. The recombinant vector pSR-IFN also harbored DHFR gene in order to amplify gene copy number. The pSR-IFN was transfected into the COS-7 and CHO/dhfr- cells in order to measure the expression level of the huIFN- in culture media by ELISA. At 60 hr post-transfection, the expression level of the huIFN- in COS-7 cells transfected with the pSR-IFN was about 30 fold higher than that of the COS-7 cells. Also, the expression level of the huIFN- in CHO/dhfr- cells transfected with the pSR-IFN was about 32 fold higher than that of the CHO/dhfr- cells at 48 hr post-transfection. For the development of stable cell line over-expressing huIFN- , the pSR-IFN was transfected into the CHO/dhfr- cells and the transfected cells were selected in media containing zeocin. PCR analysis indicated that huIFN- gene was stably replicated in the zeocin-resistant CHO/dhfr- cells. Gene amplification of the stable cell line was performed until MTX concentration reached to 1 M. Immunoblot analysis of the selected cell culture media revealed that huIFN- was stably over-expressed in the zeocin and MTX resistant CHO/dhfr- cells.